单细胞测序可以说是高分文章的宠儿，衍生出来的花式分析也受到广大科研人员喜爱。这边单测还没完全研究透，另一边就有Science杂志发表社论——迈向单分子蛋白质组学（Single-molecule proteomics），单分子蛋白组测序可谓是科研界的新idol。

图源：https://www.science.org/doi/10.1126/science.abn0001

较为完善的核酸测序技术，使单细胞转录组学和基因组学得以发展，不过蛋白质才是最主要行使功能的大分子，目前主要用质谱技术进行检测，但目前蛋白质的测序技术还有诸多难点。第一个难点在于无法方便地制造多个重复多肽进行测序，但目前Brinkerhoff等人发表的Sicence文章则开发一种“基于纳米孔的DNA测序”，可实现多次重复读取同一多肽【1】。

图源：https://www.science.org/doi/10.1126/science.abl4381

前沿进展还包括准确测定蛋白质亚型和变体以及蛋白质的翻译后修饰的新方法。受到“基于纳米孔的DNA测序”的启发，还提出“单分子荧光”、“隧道电流分析”、“纳米孔测序”。这些技术可以识别单个核苷酸的离子电流传感，甚至区分具有相同分子量的亮氨酸和赖氨酸（精准度远超常见的蛋白质质谱法）【2-5】。

图：纳米孔（绿色）和解旋酶（红色）读取DNA-蛋白质结合物（黄-紫色）。

来源：CEES DEKKER LAB TU DELFT/SCIXEL

https://www.science.org/doi/10.1126/science.abn0001

同时为了解决蛋白质二级、三级结构等折叠问题，研究人员依托纳米孔，提出包括使用带负电荷的 DNA 、载体肽 、去折叠酶或变性剂等方法，促进蛋白质的识别，有助于在多肽水平上理解蛋白质异构体多样性。简单来说，就是让复杂的蛋白更容易被测出。

近期Brinkerhoff等研究者提出一种通过可溶解旋酶来提高准确性的方法，该解旋酶可以反复与 DNA 分子结合。这种巧妙的设计确保可以读取相同的多肽，通过电场将其拉回纳米孔，然后在新解旋酶的帮助下重新读取。分辨率提高的同时降低错误率，还能够与市售的纳米孔平台兼容，优雅与实用兼备。

图：纳米孔读取多肽

图源：https://www.science.org/doi/10.1126/science.abl4381

近期的科研结果十分振奋人心，为单分子蛋白质组测序提供无限可能。但是目前仍有挑战：细胞中蛋白质数量多（例如1个简单的真核细胞中有大概4000万个蛋白质），纳米孔系统读取完所有蛋白质需要2050万小时。未来可能针对特定的蛋白质进行分析即可。

另一挑战是检测数量众多、功能复杂的蛋白质翻译后修饰，例如糖基化可能修饰的分子量较大，增加测序难度，降低精准度，可能需要使用去除糖基化的酶处理后，再进行纳米孔DNA检测方法。

小编认为，目前单细胞测序方法（结合空间转录组学）能了解细胞类型的分布，了解单个细胞的基因组和转录组，但无法得知单个细胞层面的蛋白质分子变化（很多时候DNA和RNA水平无法完全代替蛋白质的表达和功能），而这些局限性有望被这项新技术弥补。

可以预见，在单细胞测序逐渐平民化的今天，单分子蛋白组学也将逐渐克服困难，进入大众的研究视野，到那时，钱袋子也得好好准备一番了。

参考文献：

【1】H. Brinkerhoff, A. S. W. Kang, J. Liu, A. Aksimentiev, C. Dekker, Science 374, 1509 (2021).

【2】Y. Liu, A. Beyer, R. Aebersold, Cell 165, 535 (2016).

【3】J. A. Alfaro et al., Nat. Methods 18, 604 (2021).【4】J. Clarke et al., Nat. Nanotechnol. 4, 265 (2009).【5】H. Ouldali et al., Nat. Biotechnol. 38, 176 (2020).